С-реактивный белок (CRP)

С-реактивный белок человека (СРБ) является одним из так называемых белков острой фазы. Его концентрация в крови быстро увеличивается в ответ на воспаление. СРБ представляет собой 224 остатка белка с молекулярной массой мономера приблизительно 25 кДа и pI 6,4 (1-4). Его относят к пентраксинам, эволюционно консервативному семейству белков, характеризующемуся кальций-зависимым связыванием лиганда и радиальной симметрией пяти мономеров, образующих кольцо вокруг центральной поры (5).
Точная функция СРБ в естественных условиях еще не полностью ясна. Было показано, что СРБ участвует в воспалительных процессах, а также в процессах врожденного иммунитета. Важная биологическая активность СРБ определяется его способностью связываться с различными лигандами, такими как: поврежденные клеточные мембраны, апоптозные клетки и фибронектин, с наибольшим сродством к остаткам фосфохолина. Когда СРБ связан с лигандом, это может быть распознано компонентом комплемента C1q, что приводит к активации классического пути комплемента. С другой стороны, посредством взаимодействия с фактором комплемента H, CRP регулирует альтернативный путь комплемента (6).

СРБ в диагностике

В клинической практике С-реактивный белок используют в качестве основного, хотя и довольно неспецифичного, маркера воспаления. Как правило, у здоровых людей уровень СРБ обычно составляет менее 5 мг/л. При патологии концентрация СРБ имеет огромный 10 000-кратный динамический диапазон (приблизительно 0,05–500 мг/л) (7). Самые высокие уровни СРБ (выше 30 мг/л) наблюдаются при бактериальных инфекциях, таких как септический артрит, менингит и пневмония.
В 2003 году Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и Американская кардиологическая ассоциация (AHA) опубликовали заявление, в котором CRP был назван маркером воспаления, наиболее подходящим для использования в современной клинической практике для оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний (8). Многие эпидемиологические исследования показали, что СРБ является надежным независимым предиктором будущих сердечно-сосудистых событий, включая инфаркт миокарда, ишемический инсульт, заболевание периферических сосудов и внезапную сердечную смерть без каких-либо признаков сердечно-сосудистых заболеваний (согласно обзору Clearfield (9)). Рекомендации CDC/AHA поддерживают использование CRP в первичной профилактике и устанавливают пороговые значения в соответствии с категориями относительного риска: низкий риск (<1,0 мг/л), средний риск (1,0-3,0 мг/л) и высокий риск (> 3,0 мг/л). Именно почему современные высокочувствительные наборы для определения СРБ (hsCRP) направлены на распознавание уровней СРБ в нанограммах на миллилитр (нг/мл).

Клиническое использование - Прогнозирование рисков сердечно-сосудистых заболеваний - Воспаление

Реагенты для разработки hsCRP тестов

Моноклональные антитела Хайтест были использованы в новых иммунометрических аналитических системах, которые достигают превосходной чувствительности с линейным диапазоном обнаружения от 0,025 мг/л до 2,5 мг/л в магнитном биосенсорном анализе (10), и от 0,01 мг/л до 50 мг/л в иммунохемилюминометрическом анализе (11). В обоих случаях предел обнаружения составлял 0,004 мг/л. Предел обнаружения 0,0011 мг/л был достигнут в твердофазном сэндвич-флуоресцентном иммуноанализе с использованием нанокристаллов (12). Наши лучшие пары C2сс–C6сс и C5–СРБ135 и несколько других обеспечивают 10 000-кратную линейность в экспериментальных иммунофлуориметрических анализах. Наши антитела могут быть использованы для разработки высокочувствительных анализов для детекции СРБ для различных диагностических платформ. В дополнение к моноклональным антителам, мы также предоставляем очищенный нативный С-реактивный белок.

Таблица 1. Патологии, приводящие к повышению уровня СРБ

Инфекции	Бактериальные Системные/тяжелые грибковые
Аллергические осложнения после инфекции	Ревматическая лихорадка Узловатая эритема
Воспалительные заболевания	Ревматоидный артрит Ювенильный идиопатический артрит Анкилозирующий спондилит Псориатический артрит Системный васкулит Ревматическая полимиалгия Болезнь Рейтера Болезнь Крона Семейная средиземноморская лихорадка
Некроз	Инфаркт миокарда Эмболизация опухоли Острый панкреатит
Травмы	Хирургия Ожоги Переломы
Злокачественные опухоли	Лимфома Карцинома Саркома

Моноклональные антитела, специфичные к СРБ

Приложения

В нативной молекуле СРБ каждый протомер имеет двух-координированные ионы Ca2+ (13). Хайтест предлагает моноклональные антитела к СРБ, которые чувствительны или нечувствительны к присутствию Ca2+ в растворе. Некоторые из наших антител распознают антиген только в присутствии Ca2+ (клоны C3, C4). Большинство моноклонов Хайтест не зависят от присутствия Ca2+ в сэндвич-иммуноанализе и способны эффективно распознавать антиген даже в присутствии EDTA в тестируемом образце (клоны C1, C2, С2сс, C5, C6, С6сс, С7, CRP11, CRP30, CRP30cc, CRP36, CRP103, CRP135, CRP169). Все антитела к СРБ компании Хайтест тестировались в различных иммунологических приложениях.

Прямой ИФА

Все моноклональные антитела к СРБ нашей компании были протестированы в прямом ELISA и выявляли нативный СРБ с высокой чувствительностью. Большинство антител распознают нативный белок как при наличии, так и в отсутствии Ca2+, тогда как клон C3 связывается с СРБ только в присутствии ионов Ca2+ (рис.1 и рис.2).

Рисунок 1.Взаимодействие клона CRP11 с нативным СРБ человека в прямой ELISA. 100 нг нативного СРБ (Хайтест) наносили на лунки в трис-буферном солевом растворе, содержащем 2 мМ CaCl2 или 5 мМ ЭДТА.

Рисунок 2. Взаимодействие клона C3 с нативным СРБ человека в прямом ИФА. 100 нг/лунку нативного СРБ (Хайтест) наносили на лунки в трис-буферном солевом растворе, содержащем 2 мМ CaCl2 или 5 мМ ЭДТА.

Иммунодетекция СРБ в Вестерн-блоттинге

Клоны C1, CRP11, CRP36 и CRP169 распознают человеческий СРБ в вестерн-блоттинге после переноса антигена на нитроцеллюлозную мембрану. Результаты экспериментов, иллюстрирующих иммунодетекцию СРБ в вестерн-блоттинге с помощью антител CRP36 и CRP169, представлены на рис. 3.

Рисунок 3. Иммунодетекция С-реактивного белка с использованием моноклональных антител к СРБ в Вестерн-блоттинге после гель-электрофореза в SDS. Нативный СРБ наносили на гель в невосстанавливающих (А) или восстанавливающих (В) условиях. После электрофореза белок переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану и зондировали с помощью моноклонов CRP36 и CRP169. A: СРБ в невосстанавливающих условиях после гель-электрофореза SDS по Тейлору и Ван дер Бергу (14). B: СРБ в восстанавливающих условиях после гель-электрофореза SDS. Для визуализации МоАт были конъюгированы с HRP (стрептавидин-конъюгат пероксидазы хрена) и 3,3-диаминобензидинтетраги дрохлоридом (DAB) в качестве субстрата HRP.

Высокочувствительные иммуноаналитические анализы к СРБ

Все клоны были протестированы в сэндвич-флюороиммунологическом анализе в качестве антител для захвата и обнаружения с сывороткой человеческой крови при наличии или отсутствии ионов Ca2+. Лучшие пары, рекомендуемые для использования (захват - обнаружение):

• С2сс - С6сс
• С5 - С6сс
• С7 - С6сс
• C5 - CRP135сс
• CRP30cc - CRP135сс
• C3 - C6cc (чувствителен к Ca2+)
• C2cc - C4сс (чувствителен к Ca2+)

Калибровочные кривые для пар C2сс-С6сс и C5-CRP135сс показаны на рис. 4 и рис. 5 соответственно.

Моноклональные антитела производства ХайТест распознают антиген СРБ с отличной чувствительностью и хорошей кинетикой, в диапазоне линейности, превышающем четыре порядка.

Рисунок 4. Иммунодетекция СРБ (стандарта) в сэндвич-иммуноанализе по паре C2-C6.

Клон C2 – биотинилированный.

Клон C6 помечен стабильным хелатом Eu3+.

Смесь антител и образцы антигенов (100 мкл) инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с нанесённым на планшеты стрептавидином

Рисунок 5. Иммунодетекция СРБ в сэндвич-иммуноанализе парой антител C5- СРБ135.

Клон C5 – биотинилированный.

Клон СРБ135 помечен стабильным хелатом Eu3+.

Смесь антител и образцы антигенов (100 мкл) инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в планшетах, покрытых стрептавидином.

Некоторые рекомендованные пары моноклональных антител нашей компании чувствительны к наличию этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в растворе, остальные нечувствительны к ней (рис. 6). Пара C5 - CRP135сс и некоторые другие могут применяться вместе с ионами Ca2+, так и без них. Пара моноклонов C3-C6сс сильно подвержена влиянию кальция.

Рисунок 6. Влияние ЭДТА на измерения СРБ. Две разные пары антител были использованы в сэндвич-иммуноанализе. Пара C3-C6 (слева) показывает зависимость от ионов Ca2+, так как данная пара не распознает СРБ в присутствии EDTA. Пара C5-СРБ135 (справа), напротив, не зависит от EDTA в растворе. В качестве источника СРБ использовали нормальную человеческую сыворотку с добавлением 2 мМ CaCl2 или 5 мМ ЭДТА.

Информация об аффинности антител

Для некоторых приложений - турбидиметрии, нефелометрии или конкурентного иммуноанализа,-необходимо оценивать константы аффинности используемых антител. ХайТест предлагает ряд МоАт с различной аффинностью к СРБ (таблица 2). Мы оценили константы аффинности для некоторых из них с использованием технологии Biacore®. Она основана на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, который позволяет оценить взаимодействие между двумя белками в режиме реального времени. Константа аффинности получается путём визуализации констант скорости ассоциации и диссоциации. Кинетика выбранных нами моноклональных антител различается, что делает их подходящими для разработки иммуноанализа на СРБ с широким динамическим диапазоном. Выбранные кинетические значения наших антител к СРБ представлены на рисунке 7.

Таблица 2. Константы аффинности некоторых моноклональных антител к СРБ.

Клон	Kon (1/Ms)	Koff (1/s)	Kd (M)
C2cc	2.3 x 105	4.4 x 10-4	1.93×10-9
C5	1.3 x 105	2.2 x 10-3	1.7×10-8
CRP30cc	9.3 x 103	4.0 x 10-3	4.3×10-7
CRP135cc	1.5 x 105	6.6 x 10-4	4.4×10-9

Рисунок 7. Кинетические значения МоАт нашей компании к СРБ. В левой колонке указано значение Kon, в правой – Koff.

Рекомбинантный СРБ человека

Выработка СРБ в печени начинается мгновенно после единичного стимулирования, а концентрация в сыворотке поднимается выше 5 мг/мл примерно через 6 часов, достигая пиковых значений примерно через 48 часов. Период полураспада СРБ в плазме составляет около 19 часов, вне зависимости от состояния здоровья и наличия каких-либо болезней (12).

Таким образом, концентрация циркулирующего СРБ зависит исключительно от скорости выработки/синтеза СРБ, по которой можно судить об интенсивности патологических процессов, инициировавших эту выработку СРБ (17).

Рекомбинантный СРБ человека нашей компании экспрессируется в клетках млекопитающих и очищается в нативных условиях, исключающих этапы ренатурации. Рекомбинантный СРБ человека очищают с помощью аффинной хроматографии с фосфатидилхолиновой матрицей, что свидетельствует о функциональной активности рекомбинантного белка.

Рисунок 8. SDS-PAGE рекомбинантного СРБ человека в восстанавливающих условиях.

1. маркеры молекулярной массы
2. рекомбинантный СРБ человека, 2 мкг
3. рекомбинантный СРБ человека, 5 мкг

Наш рекомбинантный CRP человека (кат. No 8CR8) не содержит меток. Он находится в форме, оптимальной для хранения в жидком состоянии. Чистота белка составляет более 95% (см. рис. 8). Результаты применения рекомбинантного СРБ человека в анализах с различными парами МоАт нашей компании представлены на рисунке 9.

Рисунок 9. Калибровочная кривая для рекомбинантного СРБ человека.

A) Калибровочная кривая пары CRP30cc-CRP135cc и B) C2cc-C4cc (захват-обнаружение). Антитела подложки адсорбировали на микропланшетах для иммунологического анализа. Смесь антигенов и детектирующих антител, помеченных стабильным хелатом Eu3+, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.

Ссылки на литературу

1. Yasojima Koji et al. ” Generation of C-Reactive Protein and Complement Components in Atherosclerotic Plaques.” Am J Pathol. 2001 March; 158(3): 1039–1051.
2. Kobayashi S, Inoue N, et al. “Interaction of oxidative stress and inflammatory response in coronary plaque instability: important role of C-reactive protein.” Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003, 23:1398–1404.
3. Ciubotaru I., Potempa L.A., Wander R.C. “Production of Modified C-Reactive Proteinin U937-Derived Macrophages”. Exp Biol Med (Maywood) 2005, 230(10):762-70.
4. Diehl E. E. et al. ”Immunohistochemical Localization of modified C-reactive protein antigen in normal vascular tissue.” American Journal of the Medical Sciences 2000; 319(2):79.
5. Hirschfield G.M., Pepys M.B. “C-reactive protein and cardiovascular disease: new insights from an old molecule.” Q J Med 2003; 96:793-807.
6. Thompson D., Pepys M.B., Wood S.P. “The physiological structure of human Creactive protein and its complex with phosphocholine.” Structure 1999; 7:169-177.
7. Bıro A. et al. ”Studies on the interactions between C-reactive protein and complement proteins” Immunology 2007 May;121(1):40-50.
8. Lowe G.D.O., Pepys M.B. ”C-Reactive Protein and Cardiovascular Disease: Weighing the Evidence” Current Atherosclerosis Reports 2006, 8:421–428.
9. Ridker P.M. “C-reactive protein: a simple test to help predict risk of heart attack and stroke” Circulation. 2003; 108:e81-e85.
10. Clearfield M.B. “C-reactive protein: a new risk assessment tool for cardiovascular disease” JAOA 2005; 105(9):409-416.
11. Pearson T.A et al. “Markers of inflammation and cardiovascular disease: application and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association”. Circulation 2003 Jan 28;107(3):499-511.
12. Pepys M.B & Hirschfield G.M. “C-reactive protein: a critical update.” J Clin Invest Jun 2003;111(12):1805-1812.
13. Meyer M.H. et al. “CRP determination based on a novel magnetic biosensor.”Biosens Bioelectron 2007 Jan 15; 22(6):973-9.
14. Shiesh S.C. et al. “Determination of C-reactive protein with an ultra-sensitivity immunochemiluminometric assay”. J Immunol Methods 2006 Apr 20;311(1-2):87-95.
15. Sin K.K. et al. “Fluorogenic nanocrystals for highly sensitive detection of C-reactive protein.” IEE Proc Nanobiotechnol 2006 Jun;153(3):54-8.
16. Karolina E. Taylor and Carmen W. van den Berg “Structural and functional comparison of native pentameric, denatured monomeric and biotinylated C-reactive protein.” Immunology 2006; 120, 404–411.
17. Gershov D. et al. “C-reactive protein binds to apoptic cells, protects the cells from assembly of the terminal complement components, and sustains an antiinflammatory innate immune response: implications for systemic autoimmunity.” J Exp Med 2000;192:1353- 1363.

Поиск ссылок о С-реактивном белке в PubMed.
Посмотреть все ссылки о CRP.

Информация для заказа.

Моноклональные антитела

Название продукта	Кат. №	Клон	Изотип	Примечания
C-реактивный белок	4C28	C1	IgG2b	ИФА, ВБ , высокочувствительные
		C3	IgG1	ИФА, ИГХ, Ca2+ зависимые, высокочувствительные
		C5	IgG1	ИФА, высокочувствительные
		C7	IgG1	ИФА, ИГХ, высокочувствительные
		CRP11	IgG1	ИФА, ВБ
		CRP36	IgG2a	ИФА, ВБ, ИГХ
		CRP169	IgG2a	ИФА, ВБ
	4C28cc	C2cc	IgG1	In vitro, ИФА, высокочувствительные
		C4cc	IgG1	In vitro, ИФА, Ca2+ зависимые, высокочувствительные
		C6cc	IgG2a	In vitro, ИФА, высокочувствительные
		CRP30cc	IgG1	In vitro, ИФА, низкая аффинность
		CRP135сс	IgG2b	In vitro, ИФА, высокочувствительные

Антиген

Новинка!

Название продукта	Кат. №	Чистота	Источник
С-реактивный белок (СРБ) человека, рекомбинантный	8CR8	>95%	Рекомбинантный

Узнать подробнее:

• Кат. №4С28/4С28сс: Моноклональные антитела к С-реактивному белку (CRP)
• Кат. № 8CR8: C‑реактивный белок (CRP) человека, рекомбинантный
• Техническая информация о продукте