Легкие нейрофиламенты (NfL)

Нейрофиламенты являются основными белками цитоскелетной структуры нейронов (1). Их диаметр составляет примерно 10 нм - толще актина и тоньше миозина. Поэтому они классифицируются как промежуточные филаменты (IF) наряду с филаментами, построенными из кератинов, ядерных ламинов и других членов семейства белков IF. Нейрофиламенты состоят из четырех различных субъединиц, стехиометрия которых зависит от зрелости нейрона. Три из этих субъединиц - NfL (легкая), NfM (средняя) и NfH (тяжелая) – всегда входят в состав и относятся к IF-белкам IV типа. Четвертая субъединица может быть либо α-интернексином (также IV тип), либо периферином (тип III) для центральной и периферической нервной системы соответственно (см. Рисунок 1). NfM и NfH, которые имеют длинные и сильно заряженные С-концевые домены, в основном обнаруживаются снаружи филаментов, тогда как NfL вместе с α-интернексином или периферином формируют основу филамента (2). Таким образом, NfL играет решающую роль в процессе полимеризации нейрофиламентов, а также в поддержании структуры аксонов.

Рисунок 1. Субъединицы нейрофиламентов.

Биохимические свойства NfL

Все NF имеют вариабельную N-концевую глобулярную головку, консервативный альфа-cпиральный стержневой домен, несущий гидрофобные повторы, облегчающие формирование спиральной катушки, а также С-концевой домен. Нейрофиламенты проходят через посттрансляционные модификации, фосфорилирование и гликозилирование в их головной и хвостовой областях (3). Эти модификации способствуют формированию, структуризации и выполнению различных функций NF (2). Головной домен человеческого NfL содержит остатки серина и треонина, которые подвергаются фосфорилированию, а сайты терминации транскрипции - О-гликозилированию. Концевые домены NfM и NfH содержат богатые глутаминовой кислотой и лизином фрагменты различной длины, а также множественные участки для фосфорилирования серина. В то же время у NfL С-концевые участки гораздо короче, поэтому они фосфорилируются с меньшей интенсивностью. NfL человека состоит из 543 аминокислотных остатков с общей теоретической pI 4,63 и молекулярной массой 61,4 Да. NfL может сформировать гомополимеры in vitro (2). Схематическое изображение сборки нейрофиламентов in vivo представлено на Рисунке 2.

Рисунок 2. Схематическое изображение сборки нейрофиламентов.

NfL как диагностический маркер повреждения нейронов

Повреждение аксонов и нейродегенерация приводят к появлению нейрональных белков в спинномозговой жидкости (СМЖ). Нейрофиламенты представляют собой наиболее широко распространённые белки, которые экспрессируются исключительно в нейронах, поэтому они могут служить отличным маркером деградации нейронов (4). Многочисленные исследования показали, что нейрофиламенты могут быть маркерами таких острых состояний (как инсульт или травма), а также ряда неврологических заболеваний - болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, лобно-височная деменция, диабетическая невропатия, и другие патологические процессы, сопровождающие центральные или периферические невропатии (5). Наблюдение уровней NfL в спинномозговой жидкости или крови полезно для построения прогноза развития различных острых и хронических неврологических заболеваний, а также для оценки эффективности лечения (4).

Реагенты для разработки надежного анализа NfL

Наша компания предлагает несколько моноклональных антител (МоАт), которые распознают NfL в СМЖ с высокой специфичностью и чувствительностью и подходят для разработки чувствительного и специфического иммуноанализа NfL. Наши антитела не обладают кросс-реактивностью с белками IF типа III (Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), виментин, десмин, периферин) и некоторыми другими нейронными белками. Пары МоАт эффективно распознают как рекомбинантный, так и эндогенный NfL, и их можно использовать для различных иммунологических анализов, таких как прямой ИФА, непрямой ИФА и иммунологических анализов сэндвич- типа. Наши антитела — хороший выбор для разработки высокочувствительных иммунологических анализов, таких как хемилюминесцентный (CLIA), иммунологический анализ одиночных молекул (SIMOA) и других.

Моноклональные антитела, специфичные к NfL человека

Мы предоставляем несколько МоАт, специфичных к NfL человека, полученных от трех видов животных и предназначенных для использования в иммунологических анализах, специфичных к NfL. Более подробная информация представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Спиcок МоАт к NfL человека производства ХайТест.

Все МоАт эффективно обнаруживают NfL в различных приложениях. Из пяти возможных пар МоАт, перечисленных в Таблице 2, мы в первую очередь рекомендуем пары NF79-NF71, NF79-NF36 и NF36-NF71. Однако, поскольку эффективность анализа зависит от платформы, метки, буфера, условий анализа и т. д., мы рекомендуем использование дополнительных захватывающих или детектирующих антител для создания комбинаций 2+1 или 1+2 с целью повышения эффективности анализа.

Таблица 2. Пары наших МоАт для сэндвич-иммуноанализа NfL, рекомендуемые пары отмечены зеленым цветом.

Детектирующие антитела могут быть помечены HRP, ALP, биотином или другими метками. На Рисунках 3 и 4 показаны примеры калибровочных кривых для прототипа анализа на основе пар NF79-NF71 - колориметрического и CLIA соответственно. Предел обнаружения (LoD) в лучшем прототипе сэндвич-иммуноанализа составил 30 пг/мл для колориметрической версии и 10 пг/мл для версии CLIA соответственно. Чувствительность анализа для наших МоАт может быть значительно повышена за счет использования высокочувствительных платформ (SIMOA и другие).

Рисунок 3. Калибровочная кривая для прототипа анализа на основе пар NF79-NF71. 3-этапный сэндвич-иммуноанализ. Детектирующие антитела наносили на планшеты Costar EIA/RIA. В качестве калибратора использовали очищенный эндогенный бычий NfL (Uman Diagnostics). Детектирующие клоны метили биотином. Для выявления иммунных комплексов использовали конъюгат стрептавидин-HRP.

Рисунок 4. Калибровочная кривая для прототипа анализа CLIA на основе пар NF79-NF71. 1-этапный сэндвич-иммуноанализ. Антитела подложки наносили на магнитные шарики стрептавидина. В качестве калибратора использовали внутренний рекомбинантный NfL нашей компании. Детектирующие МоАт метили эфиром акридиния. Иммунные комплексы выявляли с помощью измерения хемилюминесценции.

Специфичность прототипов анализа NfL

Было изучено большое количество белков IF типа III и некоторых других нейронных белков для тестирования прототипов иммуноанализа сэндвич-типа. Наши исследования не установили какой-либо перекрестной активности с белками IF типа III или другими протестированными нейрональными белками. Более подробная информация представлена на Рисунке 5.

Рисунок 5. Кросс-реактивность различных прототипов анализов на различные нейрональные белки. Иммуноанализ сэндвич-типа проходил в 3 этапа. Рекомбинантные белки добавляли в концентрации 1000 нг/мл с рекомбинантным NfL для положительного контроля.

Обнаружение NfL в клинических образцах

Анализы, в которых применяются наши пары моноклональных антител (МоАт), подходят для измерения эндогенного NfL в образцах СМЖ. На Рисунке 6 представлена кривая титрования NfL в спинномозговой жидкости, измеренная с помощью прототипа ИФА-анализа на основе пары NF79-NF71. Тест- прототип NF79-NF71 также использовался для иммунодетекции NfL в образцах спинномозговой жидкости нескольких пациентов с различными диагнозами. В зависимости от диагноза, уровни NfL были низкими, умеренными или высокими (Рисунок 7).

Рисунок 6. Кривая титрования эндогенного NfL в образце СМЖ. Кривая титрования получена с использованием прототипа на паре NF79-NF71 в сэндвич-иммуноанализе. Концентрация NfL в СМЖ была предварительно измерена с помощью анализа Uman Diagnostics NFlight ® ELISA.

Рисунок 7. Иммунодетекция NfL в образцах СМЖ с помощью прототипа трехэтапного сэндвич-иммуноанализа собственного производства на основе пары NF79-NF71. Диагнозы пациентов представлены в соседней таблице. Образцы СМЖ разбавляли 4-5 раз перед измерением.

Протитипы анализов демонстрируют хорошую корреляцию с анализами, представленными на рынке. 23 образца СМЖ реальных пациентов в различных состояниях анализировались при помощи NF-Light® ELISA (Uman Diagnostics) (доступен в продаже), а также тремя тестами-прототипами на основе пар NF79-NF71, NF79-NF36 и NF36-NF71. Все упомянутые анализы представляют собой трехэтапные ИФА сэндвич- типа с биотинилированными детектирующими МоАт. Все прототипы анализов на основе наших МоАт продемонстровали хорошую линейную корреляцию с упомянутым тестом другого производителя.

Рисунок 8. Корреляция между результатами измерения NfL в 23 образцах спинномозговой жидкости с помощью NF-Light® ELISA (Uman Diagnostics) и трех прототипов ELISA анализов с антителами нашей компании: A) NF79-NF71, B) NF79-NF36 и C) NF36-NF71.

МоАт NF36 к NfL также подходят для иммунохимическое окрашивания. Результаты такого окрашивания представлены на Рисунке 9.

Рисунок 9. Иммунохимическое окрашивание NfL в культивируемых мышиных нейронах. Нейроны выделяли из гиппокампа эмбриона мыши. Первичное антитело - NF36, вторичное - кроличьи поликлональные антитела, конъюгированные с Alexa-488 (зеленый). Ядра окрашивали посредством Hoechst 33342.

Информация для заказа

Моноклональные антитела

Ссылки

1. Lee MK, Cleveland DW. Neuronal intermediate filaments. Annual Revew of Neuroscience. 1996, 19 pp.187-217.
2. Yuan A et al. Neurofilaments and Neurofilament Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2017, Apr 3; 9(4): a018309.
3. Grant P, Pant HC. Neurofilament protein synthesis and phosphorylation. Journal of Neurocytology. 2000, 29 (11-12) pp. 843-72.
4. Khali M et al. Neurofilaments as biomarkers in neurological disorders. Nature Review Neurology. 2018, Oct; 14(10) pp. 577-589.
5. Braissant O. Neurofilament Proteins in Brain Diseases. New Research on Neurofilament Proteins. 2007, pp. 25-51.