×
Прокальцитонин (ПКТ) представляет собой небольшой белок (~ 13 кДа), который синтезируется С-клетками щитовидной железы. Он считается основным маркером расстройств, которые сопровождаются системным воспалением и сепсисом.
ПКТ кодируется геном CALC-1 и является предшественником гормона кальцитонина. Он производится из пре-прокальцитонина длиной 141 аминокислоту. После удаления сигнального пептида (аминокислоты 1-25), 116 аминокислот ПКТ подвергаются последовательному расщеплению с образованием трех молекул: N-концевого фрагмента (N-концевой ПКТ, 57 аминокислотных остатков (а.к.о.)), кальцитонин (32 а.к.о.) и катакальцин (21 а.к.о.).
ПКТ принадлежит к семейству родственных белков (семейство пептидов CAPA), которое также включает кальцитонин, пептиды I и II, связанные с геном кальцитонина, амилин и адреномодулин.
Посмотреть продукцию:
|
Клиническое использование - Системное воспаление - Сепсис |
В 1993 году впервые было обнаружено повышенное содержание ПКТ у пациентов, заразившихся инфекциями бактериального происхождения. Было установлено, что вырабатываемый в результате воспаления ПКТ образовывался в паренхиматозных тканях и различных типах клеток, а не в C-клетках (2-4). Таким образом, ПКТ является оптимальным маркером для выявления бактериальных инфекций, так как у здоровых людей он остается на низком уровне, а при вирусных инфекциях поднимается незначительно.
К тому же актуальность диагностики ПКТ дополнительно подтверждается тесной корреляцией между концентрацией ПКТ и тяжестью воспаления (1, 5).
В некоторых случаях повышение концентрации ПКТ может быть вызвано факторами, не связанными с сепсисом и инфекции.
Хирургическое вмешательство, тепловой шок, множественные травмы, ожоги и кардиогенный шок также приводят к повышению уровня ПКТ (1). Кроме того, многие исследования доказывают важность наблюдения за уровнем ПКТ после операции на сердце или его трансплантации для выявления отторжения импланта из-за бактериальных или грибковых инфекций.
Рисунок 1. Аминокислотная последовательность прокальцитонина человека (116 а.к.о.), N-концевой ПКТ (1-57), кальцитонин (60-91) и катакальцин (96-116), а также рекомендованные пары антител для сэндвич-иммуноанализа ПКТ (захват-обнаружение).
Для разработки ИФА тестов для определения ПКТ мы предлагаем моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к различным фрагментам молекулы ПКТ:
N-концевому фрагменту ПКТ, кальцитонину и катакальцину. Данные антитела могут быть использованы для обнаружения как полноразмерной молекулы ПКТ, так и её участков с помощью пар антител, специфичных к различных частям ПКТ.
Эпитопная специфичность моноклонов и рекомендуемые пары для сэндвич-иммуноанализов (обнаружение-захват) показаны на рис. 1. В дополнение к антителам мы также предлагаем рекомбинантный полноразмерный антиген ПКТ, который можно использовать в качестве калибратора в иммунометрических системах для определения ПКТ или кальцитонина.
Согласно результатам исследований лучшая чувствительность наблюдалась при использовании следующих пар: P124-P138, P139-P135 и P123-P138 (см. табл. 1). Однако большинство МоАт можно использовать и в других комбинациях в зависимости от используемых платформ, в т. ч. CLIA и LF. Все комбинации показали отсутствие или малую перекрестную реакцию с изолированным кальцитонином, катакальцином, а также связанные с геном кальцитонина пептид-1 и пептид-2 (CGRP1 и CGRP2). Подробности представлены в таблице 2.
Таблица 1. Рекомендованные пары МоАт к ПКТ для сэндвич- иммуноанализов в CLIA и LF. LOD – предел чувствительности. Данные корреляции с анализом Roche Elecsys® BRAHMS на ПКТ получены в результате работы с тремя независимыми пулами образцов реальных пациентов (n=34, 46, and 103
| Основные рекомендуемые пары | ||||
| Захват- детекция | Специфичность | LoD (пг/мл) | Корреляция | Приложение |
| P124-P138 | N-C | 0.27 | 0.9961 | CLIA |
| P139-P135 | C-N | 0.28 | 0.9880 | CLIA |
| P123-P138 | N-C | 0.28 | 0.9998 | CLIA |
| P138-P135 | C-N | 0.53 | 0.9964 | CLIA |
| P141-P135 | C-N | 0.68 | 0.9973 | CLIA |
| P139-P124 | C-N | 0.73 | 0.9953 | CLIA |
| P124-P139 | N-C | 0.87 | 0.9975 | CLIA |
| P413-P139 | K-C | 1.43 | 0.9930 | CLIA |
| RC16B5-P123 | C-N | 1.47 | 0.9846 | CLIA, LF |
| P413-P141 | K-C | 1.82 | 0.9970 | CLIA |
| Другие рекомендации | ||||
| P135-P138 | N-C | 0.35 | 0.9994 | CLIA |
| P135-P139 | N-C | 0.42 | 0.9984 | CLIA |
| P141-P223 | C-N | 0.78 | 0.9850 | CLIA |
| P123-P139 | N-C | 1.09 | 0.9991 | CLIA |
| P141-P160 | C-K | 1.40 | 0.9993 | CLIA |
| P139-P223 | C-N | 1.43 | 0.9800 | CLIA |
| 16B5cc-P123 | C-N | 2.08 | 0.9523 | CLIA, LF |
| P139-P160 | C-K | 2.32 | 0.9999 | CLIA |
Таблица 2. Данные кросс-реактивности пар МоАт в сэндвич-иммуноанализе по определению ПКТ. Кальцитонин, катакальцин, CGRP1 и CGRP2 используются в концентрациях 10 нг/мл в CLIA. Данные представлены в процентах от иммунореактивности полноразмерного ПКТ.
| Пары | Специфичность | Кросс-реактивность, в % (для 10 нг/мл в CLIA) | |||
| Кальцитонин | Катакальцин | CGRP1 | CGRP2 | ||
| P124-P138 | N-C | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P139-P135 | C-N | 0.0000 | 0.0000 | 0.0000 | 0.0000 |
| P123-P138 | N-C | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P138-P135 | C-N | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P141-P135 | C-N | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P139-P124 | C-N | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P124-P139 | N-C | <0.005 | <0.005 | <0.005 | <0.005 |
| P413-P139 | K-C | 0.0335 | 0.0141 | 0.0008 | 0.0042 |
| RC16B5-P123 | C-N | 0.0231 | 0.0056 | 0.0060 | 0.0000 |
| P413-P141 | K-C | 0.0278 | 0.0043 | 0.0092 | 0.0355 |
| P135-P138 | N-C | 0.0170 | 0.0100 | 0.0030 | <0.0050 |
| P135-P139 | N-C | <0.005 | 0.0070 | 0.0410 | 0.039 |
| P141-P223 | C-N | 0.0924 | 0.0102 | 0.0201 | 0.0000 |
| P123-P139 | N-C | 0.0297 | 0.0113 | 0.0038 | 0.0065 |
| P141-P160 | C-K | 0.0154 | 0.0000 | 0.0057 | 0.0069 |
| P139-P223 | C-N | 0.0095 | 0.0067 | 0.0085 | 0.0088 |
| 16B5-P123 | C-N | 0.0175 | 0.0035 | 0.0023 | 0.0066 |
| P139-P160 | C-K | 0.0206 | 0.0046 | 0.0041 | 0.0030 |
Калибровочные кривые шести прототипов анализов представлены на рисунке 2. Мы также проверили несколько прототипов анализов на их способность обнаруживать нативный ПКТ в сыворотке крови человека с использованием образцов сыворотки от двух пациентов с сепсисом и одного здорового человека.
Данные о корреляции результатов анализа Roche Elecsys BRAHMS и наших прототипов представлены на рисунке 3 и в таблице 1. Все анализы проходили проверку на уровень ПКТ с помощью анализатора Roche Cobas e 411 или модульной платформы Roche cobas® 6000, после чего сверялись с данными наших прототипов на основе CLIA анализа.
Рисунок 2. Калибровочные кривые для шести протитипов иммуноанализов на определение ПКТ CLIA человека методом CLIA с использованием пар МоАт с различной эпитопной специфичностью.
A) P124-P138
B) P139-P135
C) P123-P138
D) P138-P135
E) P413-P139
F) P413-P141
МоАт для захвата: 0,05 мкг на лунку
МоАт для детекции, биотинилированные: 12,5 нг на лунку
Конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (ThermoFisher): 1:50000
Антиген: ПКТ человеческий рекомбинантный
Время инкубации: 30 мин.
Рисунок 3. Корреляция наших прототипов с тестом с Roche Elecsys® BRAHMS PCT.
A) P124-P138 (n=34)
B) P123-P135 (n=46)
C) P138-P135 (n=34)
D) Р139-Р135 (n=103)
E) P413-P139 (n=103)
F) Р413-Р141 (n=103)
Для графиков корреляции A-C:
МоАт для захвата: 0,05 мкг/лунку
МоАт для детекции, биотинилированные: 12,5 нг на лунку
Конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (ThermoFisher): 1:50000
Время инкубации: 30 мин.
Для графиков корреляции D-F:
МоАт для захвата, покрытые парамагнитными частицами: 20 мкг на лунку МоАт для захвата, помеченные эфиром акридиния: 30 нг на лунку
Время инкубации: 10 мин.
Наша компания разработала два МоАт против ПКТ в рекомбинантном химерном формате с константными доменами IgG1 человека (RC16B5 и P223). Рекомбинантные химерные антитела демонстрируют чувствительность, аналогичную мышиным антителам, а также позволяют избежать ложноположительных сигналов в антителах человека к Ig мыши (HAMA) и ревматоидный фактор (RF). Результаты сравнения мышиных МоАт 16B5cc и химерных МоАт RC16B5 продемонстрированы на рисунке 4.
ХайТест предлагает козьи поликлональные антитела к прокальцитонину человека (кат. № PPC3). В качестве иммуногена для данного продукта применяется человеческий рекомбинантный полноразмерный прокальцитонин. Для очистки поликлональных антител применялся иммуноаффинный метод с использованием РСТ-сефарозы в качестве аффинной матрицы.
Рекомендуемые сендвич-пары антител для использования с поликлональными антителами против прокальцитонина представлены в таблице 3.
Таблица 3. Рекомендации по парам антител для захвата-детекции поликлональных антител к прокальцитонину человека (Кат. № PPC3)
| Захват | Обнаружение |
| PPC3 | 16B5cc |
| PPC3 | P139 |
Мы проверили способность некоторых антител обнаруживать ПКТ в вестерн-блоттинге после электрофореза с SDS в восстанавливающих условиях (рис. 5)
Рисунок 5. Определение человеческого рекомбинантного ПКТ (100 нг/полосy) с помощью моноклональных антител, специфичных к кальцитонину, катакальцину и N-концевому фрагменту ПКТ, в вестерн-блоттинге после 15% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.
Рисунок 4. Сравнение анализов с использованием пар 16B5cc-P123 и RC16B5-P123, протестированных с RF и HAMA-положительными сыворотками (сыворотки здоровых доноров).
Человеческий рекомбинантный ПКТ (кат. № 8PC5) экспрессируется в E.coli в виде полноразмерного полипептида длиной 116 аминокислот без сигнального пептида и аффинных тагов (последовательность соответствует UniProt P01258 без сигнального пептида). Чистота составляет более 95% (см. Рис. 6).
Рекомбинантный ПКТ компании ХайТест может быть использован в качестве калибратора в иммуноанализах для определения уровня содержания прокальцитонина или кальцитонина.
Рисунок 6. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS- PAGE) 5 мкг очищенного человеческого рекомбинантного ПКТ в восстановительных условиях. Чистота определялась денситометрически.
Чтобы выяснить, насколько хорошо наш рекомбинантный антиген сохраняет свою иммунореактивность после растворения лиофилизированного продукта в буфере, мы сделали следующий раствор 1 мг/мл - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8 - и проверили его эффективность после хранения полученного раствора при разных температурах (рис. 7).
Также была протестирована работоспособность белка после нескольких циклов замораживания-оттаивания (рис. 4). Полученные результаты показывают, что антиген остается устойчивым и хорошо сохраняет свою активность в описанных условиях.
Мы сравнили наш рекомбинантный ПКТ (кат. № 8PC5) без тагов с рекомбинантным бестаговым ПКТ от другого поставщика.
Наши результаты показывают, что не было никакой разницы в иммунореактивности сравниваемых белков (рис. 9).
Рисунок 7. Стабильность 1 мг/мл раствора антигена при 4°C и при комнатной температуре. ПКТ в концентрации 1 мг/мл замораживали при +4°C и при комнатной температуре. Иммунореактивность измеряли по методике “сэндвич”-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.
Рисунок 8. Стабильность 1 мг/мл раствора антигена после повторных циклов замораживания-оттаивания. ПКТ в концентрации 1 мг/мл замораживали при -70 °C и оставили при комнатной температуре до полного размораживания указанное количество раз.
Иммунореактивность измеряли по методике “сэндвич”-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.
Рисунок 9. Сравнительное титрование ПКТ без тагов от Хайтест и другого поставщика. Иммунореактивность измеряли в сэндвич-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.
| Название продукта | Кат. № | Клон | Подкласс | Примечания |
| Кальцитонин | 4C10cc | P138 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ |
| P139 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| P141 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| RC16B5 | IgG1 | ИХЛА, ИХА, а.к.о. 72-81 ПКТ, рекомбинантные химерные антитела | ||
| 13G11cc | IgG1 | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| 14A2cc | IgG1 | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| 16B5cc | IgG2b | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| 24B2cc | IgG1 | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ | ||
| 4C10 | 13B9 | IgG2a | ИФА, а.к.о. 60–69 ПКТ | |
| 13F2 | IgG1 | ИФА, ВБ, а.к.о. 72–81 ПКТ | ||
| Прокальцитонин | 4PC47 | P123 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, ИХА, а.к.о. 11-25 ПКТ |
| P223 | IgG1 | ИХЛА, a.a.r. 11-25 ПКТ, рекомбинантные химерные антитела | ||
| P124 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 11-25 ПКТ | ||
| P135 | IgG2a | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 11-25 ПКТ | ||
| P413 | IgG2a | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 96-105 ПКТ, крысиные/мышиные гетерогибридомные антитела | ||
| P160 | IgG1 | In vitro, ИХЛА, а.к.о. 102-108 ПКТ | ||
| 44D9 | IgG2a | ИФА, ВБ | ||
| 6F10 | IgG1 | ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ | ||
| 27A3cc | IgG2a | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ | ||
| 38F11 | IgG1 | ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ | ||
| 42cc | IgG2a | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ | ||
| 22A11 | IgG1 | ИФА, ВБ, а.к.о. 96-105 ПКТ | ||
| 14C12cc | IgG1 | In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 102-111 ПКТ | ||
| 18B7 | IgG1 | ИФА, ВБ, а.к.о. 102-111 ПКТ |
| Название продукта | Кат. № | Животное | Примечания |
| Прокальцитонин | PPC3 | Коза | ИФА |
| Название продукта | Кат. № | Чистота | Источник |
| Прокальцитонин рекомбинантный, без меток | 8PC5 | >95% | Рекомбинант |
Обратите внимание, что некоторые данные, представленные в этом документе, были получены при работе с моноклональными антителами, полученными in vivo. МоАт, произведенные in vitro, должны показывать аналогичные результаты.
Copyright © 2024 Hytest Ltd.
