Прокальцитонин человека

undefined

Прокальцитонин (ПКТ) представляет собой небольшой белок (~ 13 кДа), который синтезируется С-клетками щитовидной железы. Он считается основным маркером расстройств, которые сопровождаются системным воспалением и сепсисом.

ПКТ кодируется геном CALC-1 и является предшественником гормона кальцитонина. Он производится из пре-прокальцитонина длиной 141 аминокислоту. После удаления сигнального пептида (аминокислоты 1-25), 116 аминокислот ПКТ подвергаются последовательному расщеплению с образованием трех молекул: N-концевого фрагмента (N-концевой ПКТ, 57 аминокислотных остатков (а.к.о.)), кальцитонин (32 а.к.о.) и катакальцин (21 а.к.о.).

ПКТ принадлежит к семейству родственных белков (семейство пептидов CAPA), которое также включает кальцитонин, пептиды I и II, связанные с геном кальцитонина, амилин и адреномодулин.


Посмотреть продукцию:

Клиническое использование

- Системное воспаление

- Сепсис

ПКТ в диагностике

В 1993 году впервые было обнаружено повышенное содержание ПКТ у пациентов, заразившихся инфекциями бактериального происхождения. Было установлено, что вырабатываемый в результате воспаления ПКТ образовывался в паренхиматозных тканях и различных типах клеток, а не в C-клетках (2-4). Таким образом, ПКТ является оптимальным маркером для выявления бактериальных инфекций, так как у здоровых людей он остается на низком уровне, а при вирусных инфекциях поднимается незначительно.

К тому же актуальность диагностики ПКТ дополнительно подтверждается тесной корреляцией между концентрацией ПКТ и тяжестью воспаления (1, 5).

В некоторых случаях повышение концентрации ПКТ может быть вызвано факторами, не связанными с сепсисом и инфекции.

Хирургическое вмешательство, тепловой шок, множественные травмы, ожоги и кардиогенный шок также приводят к повышению уровня ПКТ (1). Кроме того, многие исследования доказывают важность наблюдения за уровнем ПКТ после операции на сердце или его трансплантации для выявления отторжения импланта из-за бактериальных или грибковых инфекций.

undefined


Рисунок 1. Аминокислотная последовательность прокальцитонина человека (116 а.к.о.), N-концевой ПКТ (1-57), кальцитонин (60-91) и катакальцин (96-116), а также рекомендованные пары антител для сэндвич-иммуноанализа ПКТ (захват-обнаружение).

Разработка иммунометрических систем и рекомендованные пары

Для разработки ИФА тестов для определения ПКТ мы предлагаем моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к различным фрагментам молекулы ПКТ:

N-концевому фрагменту ПКТ, кальцитонину и катакальцину. Данные антитела могут быть использованы для обнаружения как полноразмерной молекулы ПКТ, так и её участков с помощью пар антител, специфичных к различных частям ПКТ.

Эпитопная специфичность моноклонов и рекомендуемые пары для сэндвич-иммуноанализов (обнаружение-захват) показаны на рис. 1. В дополнение к антителам мы также предлагаем рекомбинантный полноразмерный антиген ПКТ, который можно использовать в качестве калибратора в иммунометрических системах для определения ПКТ или кальцитонина.

Согласно результатам исследований лучшая чувствительность наблюдалась при использовании следующих пар: P124-P138, P139-P135 и P123-P138 (см. табл. 1). Однако большинство МоАт можно использовать и в других комбинациях в зависимости от используемых платформ, в т. ч. CLIA и LF. Все комбинации показали отсутствие или малую перекрестную реакцию с изолированным кальцитонином, катакальцином, а также связанные с геном кальцитонина пептид-1 и пептид-2 (CGRP1 и CGRP2). Подробности представлены в таблице 2.

Таблица 1. Рекомендованные пары МоАт к ПКТ для сэндвич- иммуноанализов в CLIA и LF. LOD – предел чувствительности. Данные корреляции с анализом Roche Elecsys® BRAHMS на ПКТ получены в результате работы с тремя независимыми пулами образцов реальных пациентов (n=34, 46, and 103

Основные рекомендуемые пары
Захват- детекция Специфичность LoD (пг/мл) Корреляция Приложение
P124-P138 N-C 0.27 0.9961 CLIA
P139-P135 C-N 0.28 0.9880 CLIA
P123-P138 N-C 0.28 0.9998 CLIA
P138-P135 C-N 0.53 0.9964 CLIA
P141-P135 C-N 0.68 0.9973 CLIA
P139-P124 C-N 0.73 0.9953 CLIA
P124-P139 N-C 0.87 0.9975 CLIA
P413-P139 K-C 1.43 0.9930 CLIA
RC16B5-P123 C-N 1.47 0.9846 CLIA, LF
P413-P141 K-C 1.82 0.9970 CLIA
Другие рекомендации
P135-P138 N-C 0.35 0.9994 CLIA
P135-P139 N-C 0.42 0.9984 CLIA
P141-P223 C-N 0.78 0.9850 CLIA
P123-P139 N-C 1.09 0.9991 CLIA
P141-P160 C-K 1.40 0.9993 CLIA
P139-P223 C-N 1.43 0.9800 CLIA
16B5cc-P123 C-N 2.08 0.9523 CLIA, LF
P139-P160 C-K 2.32 0.9999 CLIA

Таблица 2. Данные кросс-реактивности пар МоАт в сэндвич-иммуноанализе по определению ПКТ. Кальцитонин, катакальцин, CGRP1 и CGRP2 используются в концентрациях 10 нг/мл в CLIA. Данные представлены в процентах от иммунореактивности полноразмерного ПКТ.

Пары Специфичность Кросс-реактивность, в % (для 10 нг/мл в CLIA)
Кальцитонин Катакальцин CGRP1 CGRP2
P124-P138 N-C <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P139-P135 C-N 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
P123-P138 N-C <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P138-P135 C-N <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P141-P135 C-N <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P139-P124 C-N <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P124-P139 N-C <0.005 <0.005 <0.005 <0.005
P413-P139 K-C 0.0335 0.0141 0.0008 0.0042
RC16B5-P123 C-N 0.0231 0.0056 0.0060 0.0000
P413-P141 K-C 0.0278 0.0043 0.0092 0.0355
P135-P138 N-C 0.0170 0.0100 0.0030 <0.0050
P135-P139 N-C <0.005 0.0070 0.0410 0.039
P141-P223 C-N 0.0924 0.0102 0.0201 0.0000
P123-P139 N-C 0.0297 0.0113 0.0038 0.0065
P141-P160 C-K 0.0154 0.0000 0.0057 0.0069
P139-P223 C-N 0.0095 0.0067 0.0085 0.0088
16B5-P123 C-N 0.0175 0.0035 0.0023 0.0066
P139-P160 C-K 0.0206 0.0046 0.0041 0.0030

Калибровочные кривые шести прототипов анализов представлены на рисунке 2. Мы также проверили несколько прототипов анализов на их способность обнаруживать нативный ПКТ в сыворотке крови человека с использованием образцов сыворотки от двух пациентов с сепсисом и одного здорового человека.

Данные о корреляции результатов анализа Roche Elecsys BRAHMS и наших прототипов представлены на рисунке 3 и в таблице 1. Все анализы проходили проверку на уровень ПКТ с помощью анализатора Roche Cobas e 411 или модульной платформы Roche cobas® 6000, после чего сверялись с данными наших прототипов на основе CLIA анализа.

undefined


Рисунок 2. Калибровочные кривые для шести протитипов иммуноанализов на определение ПКТ CLIA человека методом CLIA с использованием пар МоАт с различной эпитопной специфичностью.

A) P124-P138

B) P139-P135

C) P123-P138

D) P138-P135

E) P413-P139

F) P413-P141

МоАт для захвата: 0,05 мкг на лунку

МоАт для детекции, биотинилированные: 12,5 нг на лунку

Конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (ThermoFisher): 1:50000

Антиген: ПКТ человеческий рекомбинантный

Время инкубации: 30 мин.

undefined


Рисунок 3. Корреляция наших прототипов с тестом с Roche Elecsys® BRAHMS PCT.

A) P124-P138 (n=34)

B) P123-P135 (n=46)

C) P138-P135 (n=34)

D) Р139-Р135 (n=103)

E) P413-P139 (n=103)

F) Р413-Р141 (n=103)

Для графиков корреляции A-C:

МоАт для захвата: 0,05 мкг/лунку

МоАт для детекции, биотинилированные: 12,5 нг на лунку

Конъюгат стрептавидина с полимеризованной пероксидазой (ThermoFisher): 1:50000

Время инкубации: 30 мин.

Для графиков корреляции D-F:

МоАт для захвата, покрытые парамагнитными частицами: 20 мкг на лунку МоАт для захвата, помеченные эфиром акридиния: 30 нг на лунку

Время инкубации: 10 мин.

Рекомбинантные химерные антитела к ПКТ

Наша компания разработала два МоАт против ПКТ в рекомбинантном химерном формате с константными доменами IgG1 человека (RC16B5 и P223). Рекомбинантные химерные антитела демонстрируют чувствительность, аналогичную мышиным антителам, а также позволяют избежать ложноположительных сигналов в антителах человека к Ig мыши (HAMA) и ревматоидный фактор (RF). Результаты сравнения мышиных МоАт 16B5cc и химерных МоАт RC16B5 продемонстрированы на рисунке 4.

Поликлональные антитела против прокальцитонина

ХайТест предлагает козьи поликлональные антитела к прокальцитонину человека (кат. № PPC3). В качестве иммуногена для данного продукта применяется человеческий рекомбинантный полноразмерный прокальцитонин. Для очистки поликлональных антител применялся иммуноаффинный метод с использованием РСТ-сефарозы в качестве аффинной матрицы.

Рекомендуемые сендвич-пары антител для использования с поликлональными антителами против прокальцитонина представлены в таблице 3.

Таблица 3. Рекомендации по парам антител для захвата-детекции поликлональных антител к прокальцитонину человека (Кат. № PPC3)

Захват Обнаружение
PPC3 16B5cc
PPC3 P139

Моноклональные антитела, специфичные к ПКТ

Мы проверили способность некоторых антител обнаруживать ПКТ в вестерн-блоттинге после электрофореза с SDS в восстанавливающих условиях (рис. 5)

undefined

Рисунок 5. Определение человеческого рекомбинантного ПКТ (100 нг/полосy) с помощью моноклональных антител, специфичных к кальцитонину, катакальцину и N-концевому фрагменту ПКТ, в вестерн-блоттинге после 15% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.

undefined


Рисунок 4. Сравнение анализов с использованием пар 16B5cc-P123 и RC16B5-P123, протестированных с RF и HAMA-положительными сыворотками (сыворотки здоровых доноров).

Рекомбинантный прокальцитонин человека

Человеческий рекомбинантный ПКТ (кат. № 8PC5) экспрессируется в E.coli в виде полноразмерного полипептида длиной 116 аминокислот без сигнального пептида и аффинных тагов (последовательность соответствует UniProt P01258 без сигнального пептида). Чистота составляет более 95% (см. Рис. 6).

Рекомбинантный ПКТ компании ХайТест может быть использован в качестве калибратора в иммуноанализах для определения уровня содержания прокальцитонина или кальцитонина.

undefined


Рисунок 6. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS- PAGE) 5 мкг очищенного человеческого рекомбинантного ПКТ в восстановительных условиях. Чистота определялась денситометрически.

Исследования стабильности

Чтобы выяснить, насколько хорошо наш рекомбинантный антиген сохраняет свою иммунореактивность после растворения лиофилизированного продукта в буфере, мы сделали следующий раствор 1 мг/мл - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8 - и проверили его эффективность после хранения полученного раствора при разных температурах (рис. 7).

Также была протестирована работоспособность белка после нескольких циклов замораживания-оттаивания (рис. 4). Полученные результаты показывают, что антиген остается устойчивым и хорошо сохраняет свою активность в описанных условиях.

Сравнительное исследование

Мы сравнили наш рекомбинантный ПКТ (кат. № 8PC5) без тагов с рекомбинантным бестаговым ПКТ от другого поставщика.

Наши результаты показывают, что не было никакой разницы в иммунореактивности сравниваемых белков (рис. 9).

undefined


Рисунок 7. Стабильность 1 мг/мл раствора антигена при 4°C и при комнатной температуре. ПКТ в концентрации 1 мг/мл замораживали при +4°C и при комнатной температуре. Иммунореактивность измеряли по методике “сэндвич”-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.

undefined


Рисунок 8. Стабильность 1 мг/мл раствора антигена после повторных циклов замораживания-оттаивания. ПКТ в концентрации 1 мг/мл замораживали при -70 °C и оставили при комнатной температуре до полного размораживания указанное количество раз.

Иммунореактивность измеряли по методике “сэндвич”-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.

undefined


Рисунок 9. Сравнительное титрование ПКТ без тагов от Хайтест и другого поставщика. Иммунореактивность измеряли в сэндвич-ELISA парой моноклональных антител 16B5-42.

Информация для заказа

Моноклональные антитела

Название продукта Кат. № Клон Подкласс Примечания
Кальцитонин 4C10cc P138 IgG1 In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ
P139 IgG1 In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ
P141 IgG1 In vitro, ИХЛА, а.к.о. 72-81 ПКТ
RC16B5 IgG1 ИХЛА, ИХА, а.к.о. 72-81 ПКТ, рекомбинантные химерные антитела
13G11cc IgG1 In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ
14A2cc IgG1 In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ
16B5cc IgG2b In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ
24B2cc IgG1 In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 72-81 ПКТ
4C10 13B9 IgG2a ИФА, а.к.о. 60–69 ПКТ
13F2 IgG1 ИФА, ВБ, а.к.о. 72–81 ПКТ
Прокальцитонин 4PC47 P123 IgG1 In vitro, ИХЛА, ИХА, а.к.о. 11-25 ПКТ
P223 IgG1 ИХЛА, a.a.r. 11-25 ПКТ, рекомбинантные химерные антитела
P124 IgG1 In vitro, ИХЛА, а.к.о. 11-25 ПКТ
P135 IgG2a In vitro, ИХЛА, а.к.о. 11-25 ПКТ
P413 IgG2a In vitro, ИХЛА, а.к.о. 96-105 ПКТ, крысиные/мышиные гетерогибридомные антитела
P160 IgG1 In vitro, ИХЛА, а.к.о. 102-108 ПКТ
44D9 IgG2a ИФА, ВБ
6F10 IgG1 ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ
27A3cc IgG2a In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ
38F11 IgG1 ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ
42cc IgG2a In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 21-40 ПКТ
22A11 IgG1 ИФА, ВБ, а.к.о. 96-105 ПКТ
14C12cc IgG1 In vitro, ИФА, ВБ, а.к.о. 102-111 ПКТ
18B7 IgG1 ИФА, ВБ, а.к.о. 102-111 ПКТ

Поликлональные антитела

Название продукта Кат. № Животное Примечания
Прокальцитонин PPC3 Коза ИФА

Антиген

Название продукта Кат. № Чистота Источник
Прокальцитонин рекомбинантный, без меток 8PC5 >95% Рекомбинант

Обратите внимание, что некоторые данные, представленные в этом документе, были получены при работе с моноклональными антителами, полученными in vivo. МоАт, произведенные in vitro, должны показывать аналогичные результаты.

Ссылки на литературу.

  1. Assicot M, et al. (1993) High serum procalcitonin con- centrations in patients with sepsis and infection. Lancet 341(8844), 515-518.
  2. Linscheid P, et al. (2003) In vitro and in vivo calcitonin I gene expression in parenchymal cells: A novel product of human adipose tissue. Endocrinology 144, 5578-5584.
  3. Simon L, et al. (2004) Serum procalcitonin and C-re- active protein levels as markers of bacterial infection: A systematic review and meta-analysis. Clin. Infect. Dis. 39, 206-217.
  4. Sponholz C, et al. (2006) Diagnostic value and prognos- tic implications of serum procalcitonin after cardiac sur- gery: a systematic review of the literature. Critical Care 10, R145.
  5. Meisner M and Reinhart K (2001) Is procalcitonin really a marker of sepsis? Int J Intensive Care 8(1), 15-25.
Чтобы быть в курсе новых продуктов и научных открытий

Спасибо Вам за подписку!