×
Фибриноген – это белок крови, из которого образуются сгустки фибрина при свертывании крови или тромботическом процессе. Фибриноген состоит из двух одинаковых субъединиц, которые содержат три полипептидные цепи: α, β и γ. Во время свертывания крови фибриноген сначала превращается в фибрин под действием тромбина, затем эти мономеры фибрина полимеризуются с образованием сгустков фибрина. При фибринолизе сгустки фибрина расщепляются плазмином, и в кровоток высвобождаются продукты разложения фибрина (FDP) с разной молекулярной массой.
D-димер (молекулярный вес 180 кДа) является конечным продуктом разложения фибрина. Он состоит из остатков всех трех цепей (α, β и γ цепей) фибриногена, сшитых дисульфидными связями. Димерная структура D-димера поддерживается двумя ковалентными межмолекулярными изопептидными связями между γ-цепями.
Д-димер в диагностике
Уровни D-димера у здоровых людей
составляют менее 0,5 мкг/мл. Повышенные уровни D-димера были обнаружены в крови
пациентов с тромбозом легких (или тромбоэмболией легочной артерии – ТЭЛА),
тромбозом глубоких вен (ТГВ) и атеросклерозом. Считается, что повышенный
уровень D-димера в крови является надежным маркером патологической коагуляции,
которая лежит в основе патогенеза большинства сердечно-сосудистых заболеваний
(1, 2). Он широко используется для исключения диагноза тромбоза глубоких вен
(3).
Несмотря на долгую историю
использования теста на D-димер в клинической практике, существует много
проблем, касающихся количественного определения D-димера в образцах плазмы. Плазма
пациента содержит широкий спектр FDP разных размеров наряду с самим D-димером. Все
эти продукты обладают эпитопом D-димерного антигена. Следовательно, антитела,
специфичные к D-димеру, также распознают FDP. Тем не менее, существует большая
разница между результатами, полученными различными иммунодиагностическими
тестами. Это можно объяснить различиями в специфичности антител; некоторые
антитела и пары антител распознают D-димер лучше, чем FDP и наоборот. До сих
пор все попытки стандартизации и гармонизации не привели к удовлетворительным
результатам, и это является распространённой причиной проблем в повседневной
практике (4).
Для точного определения всех FDP и D-димера, и для использования D-димера в качестве стандарта моноклональные антитела должны обнаруживать FDP и D-димер с одинаковой специфичностью. Кроме того, наборы на D-димер не должны обнаруживать фибриноген, концентрация которого в плазме в 1000 раз выше, чем концентрация D-димера.
|
Клиническое использование - Маркер патологического свертывания крови - Исключение тромбоза любой этиологии, в т.ч. вызывающего ТГВ или ТЭЛА |
Для разработки иммунометрических аналитических систем для определения D-димера мы предлагаем ряд моноклональных антител, специфичных к D-димеру и FDP. В дополнение к антителам мы предлагаем D-димер, который производится из свернувшегося фибриногена путем расщепления плазмином.
FDP и D-димер, наиболее деградированная форма FDP, появляются в крови человека в результате протеолитического расщепления сгустков фибрина. Соотношение продуктов деградации фибрина не является постоянным и может отличаться от пациента к пациенту (см. Рис. 3). Мы разработали иммунометрическую систему, которая распознает FDP и D-димер с одинаковой специфичностью, что позволяет снизить погрешность в измерении FDP в крови. Такой подход может в перспективе стать первым серьезным шагом к созданию единой универсальной методики анализа D-димера.
Хайтест предлагает моноклональные антитела DD189сс и DD255сс, которые распознают D-димер и высокомолекулярные продукты разложения фибрина с одинаковой специфичностью в сэндвич- флюороиммуноанализе при концентрации антигена до 1 мкг/мл (рис. 2).
Для «сэндвич»-ИФА плазму можно развести в 10-кратном 20 мМ трис-HCl-буфере, рН 7,5, содержащем 0,15 М NaCl. Оба клона окрашивали D-димер в вестерн-блоттинге в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (рис. 5 A и B).
Характеристика моноклонов DD189сс и DD255сс представлена в статье Kogan et al. (5)
РИСУНОК 2. Пара антител DD189сс-DD255сс определяет D-димер и FDP с одинаковой специфичностью. В лунки планшета нанесли 100 мкл клона DD189сс (10 мкг/мл в PBS) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После трех промывок трис-буферным солевым раствором (TBS), содержащим 0,05% Tween 20, добавили 50 мкл меченного Eu3 + клона DD255сс (4 мкг/мл в буфере для анализа Delfia) и 25 мкл D-димера или FDP. Инкубировали, перемешивая, в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки в каждую лунку добавили 300 мкл раствора Lanfia, и после 3 минут интенсивного перемешивания измерили флуоресцентные сигналы на 1420 Victor ™ Multilabel Counter (Wallac, Финляндия).
Мы провели анализ плазмы от пациентов с двумя различными расстройствами с помощью гель-фильтрации, в результате которого было установлено, что соотношение D-димера и FDP не является постоянным (рис. 3). Следовательно, иммуноаналитические системы должны в равной степени распознавать D-димер и FDP, чтобы обеспечить более точное определение всех продуктов распада, возникающих в результате разложения фибрина.
РИСУНОК 3. ВЭЖХ гель-фильтрация образцов плазмы от пациентов с тромбозом (А) и после хирургической операции (Б). 200-500 мкл плазмы наносили на колонку Superdex 200 16/60 со скоростью потока 1 мл/мин. Фракции объемом 1 мл анализировали парой DD189-DD255 в сэндвич-ИФА, как описано на рис.2.
Рекомендованные пары представлены в таблице 1. Они успешно распознают D-димер и высокомолекулярные продукты разложения фибрина и не обнаруживают фибриноген (рис. 4).
ТАБЛИЦА 1. Рекомендуемые пары для сэндвич-ИФА для обнаружения D-димера в плазме человека. Обратите внимание, эти рекомендации и наблюдения основаны на полученных результатах с использованием нашей собственной иммунометрической платформы DELFIA®.
| Пара (подложка- конъюгат) | Примечания |
|---|---|
| DD189cc – DD255cc | Одинаковая специфичность к D-димеру и высокомолекулярным продуктам деградации фибрина |
| DD2 – DD41cc | Более специфичная пара к высокомолекулярным продуктам деградации фибрина при высоких концентрациях |
| DD2 – DD4* | Приблизительно одинаковая специфичность к д-димеру и высокомолекулярным продуктам деградации фибрина |
* Ввиду кросс-реактивности DD4 с фибриногеном, мы настоятельно рекомендуем использовать его в качестве детектирующего антитела. В сэндвич-иммуноанализе плазма должна быть разведена, по крайней мере, в 2-кратном растворе 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,1% Твин 20, чтобы избежать неспецифического связывания. Каждый из следующих этапов иммуноанализа должен сопровождаться инкубацией и промывкой: нанесение моноклонального антитела на подложку, добавление образца, а позже – конъюгированного моноклонального антитела.
РИСУНОК 4. Кросс-реактивность с фибриногеном при использовании в иммунометрических системах пар антител DD2- DD41 и DD189-DD255 отсутствует. 5 мг фибриногена (Calbiochem) наносили на колонку Superdex 200 16/60 с использованием TBS, pH 7,5 при скорости потока 1 мл/мин. Фракции объемом 1 мл анализировали в сэндвич-анализе с помощью пар DD2-DD41 и DD189-DD255, как описано на рисунке 3(у финов рис.3, в русской – 2). Результаты показывают, что иммунометрические системы на D-димер не обнаруживают фибриноген, несмотря на присутствие некоторых высокомолекулярных продуктов деградации фибрина в препарате.
Наши антитела к D-димеру также могут применяться при методе вестерн-блоттинга. В проведенных тестах все моноклональные антитела окрашивали невосстановленный D-димер, а некоторые из них окрашивали и восстановленный D-димер (рис. 5 A и B соответственно).
РИСУНОК 5. Вестерн-блот D-димера. D-димер (кат. № 8D70) анализировали в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих (A) или восстанавливающих (B) условиях с использованием разделяющего геля 7,5–12,5% и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 7% молоком в PBST в течение 30 минут, полосы белка окрашивали различными моноклональными антителами к D-димеру (10 мкг/мл) в течение 1 часа, используя Mini-Protean® II MultiScreen (Био- Рад). После промывания с помощью PBST, добавляли пероксидазный конъюгат козьих анти-мышиных антител специфичных к Fc-фрагменту IgG (разведённый в соответствии с рекомендациями производителя) и инкубировали в течение часа. После промывания PBST иммунные комплексы визуализировали с помощью DAB/перекиси водорода в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5.
Уже более 10 лет Хайтест является одним из ведущих мировых поставщиков нативного D-димера. Мы предлагаем D-димер высокой степени очистки, полученный из человеческой плазмы.
РИСУНОК 6. SDS-PAGE очищенного D-димера в невосстанавливающих условиях. Гель окрашивали с использованием кумасси бриллиантового голубого R-250.
Полоса 1: Весовой стандарт
Полоса 2: D-димер (3 мкг)
| Название продукта | Кат. № | Клон | Подкласс | Примечания |
|---|---|---|---|---|
| D-димер | 4D30 | DD1 | IgG2a | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном |
| DD2 | IgG2b | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD3cc | IgG2b | In vitro, ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD4 * | IgG2b | ИФА, ВБ, К/р с фибриногеном (для обнаружения MAb) | ||
| DD5 * | IgG2b | ИФА, ВБ, К/р с фибриногеном (для обнаружения MAb) | ||
| DD6cc * | IgG2a | In vitro, ИФА, ВБ, К/р с фибриногеном (для обнаружения MAb) | ||
| DD22 | IgG2a | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD41cc | IgG2a | In vitro, ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD44cc | IgG2b | In vitro, ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD46 | IgG2a | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD93 | IgG1 | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD189cc * | IgG1 | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном | ||
| DD255cc * | IgG1 | ИФА, ВБ, Нет к/р с фибриногеном |
* Примечание. При использовании данных антител в качестве детекторных, иммуноаналитический набор может давать ложноположительные результаты у пациентов, получавших стрептокиназу.
| Название продукта | Кат. № | Чистота | Источник |
|---|---|---|---|
| D-димер | 8D70 | >90% | Плазма человека |
Обратите внимание, что некоторые или все данные, представленные в настоящем техническом описании, были подготовлены с использованием моноклональных антител, произведенных in vivo. Ожидается, что моноклональные антитела, полученные in vitro, будут иметь аналогичные характеристики.
Посмотреть продукцию:
Copyright © 2024 Hytest Ltd.
