Д-димер (D-dimer) представляет собой плазменный гликопротеин, являющийся конечным продуктом расщепления поперечно-сшитого нерастворимого фибрина. Молекула фибриногена является димером и состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит три полипептидные цепи: альфа, бета и гамма. В процессе коагуляции под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин-мономеры, которые полимеризуются в растворимый фибрин-полимер. Последующая ковалентная сшивка под действием фактора XIIIa приводит к образованию нерастворимого фибринового матрикса. В ходе фибринолиза сгустки подвергаются ферментативному расщеплению плазмином, что приводит к высвобождению в кровоток продуктов деградации фибрина (ПДФ) различной молекулярной массы. Д-димер с молекулярной массой около 180 кДа состоит из остатков всех трех цепей, соединенных внутренними дисульфидными мостиками, при этом его димерная структура стабилизирована двумя ковалентными межмолекулярными изопептидными связями между гамма-цепями.
Базальный уровень Д-димера в плазме крови здоровых лиц не превышает 0,5 мкг/мл. Выраженное повышение концентрации маркера наблюдается при тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА), тромбозе глубоких вен (ТГВ), атеросклеротическом поражении сосудов, а также синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдроме). Рост содержания аналита в системном кровотоке служит надежным признаком патологической активации коагуляционного гемостаза, лежащей в основе патогенеза большинства сердечно-сосудистых заболеваний. Данный тест повсеместно применяется в лабораторной медицине в качестве высокочувствительного исключающего критерия при подозрении на ТГВ. Количественная детекция Д-димера in vitro выполняется с помощью специфичных тест-систем, при этом наибольшую аналитическую чувствительность и отрицательную прогностическую ценность (до 99%) демонстрируют методы на основе иммунофлуоресцентного анализа.
Несмотря на длительный опыт применения теста в клинической практике, стандартизация методов количественного определения Д-димера в плазме крови остается нерешенной проблемой лабораторной медицины. Плазма пациентов наряду со свободным Д-димером содержит гетерогенный спектр продуктов деградации фибрина (ПДФ) различной молекулярной массы и степени полимеризации. Все эти фрагменты несут в своей структуре специфический неоэпитоп Д-димера, вследствие чего специфичные к нему антитела неизбежно распознают и другие продукты распада фибринового матрикса. Высокая вариабельность результатов, получаемых на аналитических платформах разных производителей, обусловлена различиями в эпитопной специфичности используемых реагентов: отдельные клоны моноклональных антител и их комбинации обладают разным сродством к свободному аналиту и высокомолекулярным комплексам ПДФ. Для обеспечения высокой аналитической точности и корректного использования Д-димера в качестве калибратора моноклональные антитела должны обладать равной специфичностью к свободному пептиду и фракциям ПДФ. Кроме того, критическим требованием к тест-системам является полное отсутствие перекрестной реактивности с интактным фибриногеном, плазменная концентрация которого превышает уровень Д-димера более чем в 1000 раз, что напрямую влияет на надежность оценки коагуляционного гемостаза и достоверность исключения тромбоэмболии.
Для разработки и серийного производства высокочувствительных тест-систем «Хайтест» предлагает широкий ассортимент моноклональных антител, специфичных к неоэпитопам Д-димера и продуктов деградации фибрина (ПДФ). Линейка продукции также включает высокоочищенный нативный антиген Д-димера, получаемый методом контролируемого плазминового протеолиза фибринового сгустка человека и предназначенный для использования в качестве калибратора или стандарта.
Различные фракции ПДФ и свободный Д-димер поступают в системный кровоток в результате ферментативного расщепления тромбов. Соотношение этих фрагментов не является постоянным и характеризуется выраженной межиндивидуальной вариабельностью в зависимости от характера клинического состояния пациента. Предлагаемые клоны моноклональных антител обладают эквивалентной специфичностью как к ПДФ, так и к свободному Д-димеру, что минимизирует аналитическое смещение при определении продуктов распада фибрина в плазме или цельной крови. Применение реагентов с равной аффинностью к различным фракциям продуктов деградации фибрина открывает новые возможности для международной стандартизации и гармонизации результатов измерений Д-димера.
В линейке продуктов «Хайтест» представлены моноклональные антитела DD189cc и DD255cc, которые с одинаковой аффинностью распознают свободный Д-димер и высокомолекулярные продукты распада фибрина методом «сэндвич»-иммунофлуоресцентного анализа при концентрациях аналита до 1 мкг/мл. При постановке сэндвич-иммуноанализа образцы плазмы крови рекомендуется разводить в 10 раз 20 мМ Трис-HCl буфером (pH 7,5, содержащим 0,15 М NaCl). Оба клона эффективно выявляют Д-димер методом вестерн-блоттинга как в редуцирующих, так и в нередуцирующих условиях.
Влияние межиндивидуальной вариабельности фракций ПДФ
Проведенный фракционный анализ образцов плазмы крови пациентов с венозным тромбозом и пациентов в послеоперационном периоде методом эксклюзионной ВЭЖХ подтвердил, что профиль распределения и соотношение концентраций свободного Д-димера и ПДФ нестабильны. Следовательно, для обеспечения высокой точности измерений используемые в КЛД диагностические тест-системы должны в равной степени распознавать все фракции продуктов распада фибринового матрикса. Рекомендуемые аналитические пары высокоспецифичны к поперечно-сшитым структурам и не проявляют перекрестной реактивности с интактным плазменным фибриногеном. Комбинация DD189cc - DD255cc обеспечивает эквивалентную специфичность к свободному Д-димеру и высокомолекулярным фракциям ПДФ. В свою очередь, аналитическая пара DD2 - DD41cc демонстрирует повышенную селективность к высокомолекулярным продуктам деградации фибрина при избыточных концентрациях аналита. Для комбинации DD2 - DD4 характерна сопоставимая аффинность к свободному Д-димеру и продуктам распада фибрина.
Ввиду частичной перекрестной реактивности клона DD4 с интактным фибриногеном, этот клон рекомендуется применять строго в качестве детекционного антитела (компонента конъюгата). При постановке сэндвич-иммуноанализа образцы плазмы крови разводят как минимум в два раза буферным раствором состава: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 1 М NaCl, 0,1% Tween 20, что позволяет полностью исключить эффекты неспецифического связывания. Каждый этап анализа сопровождается инкубацией и промывкой: иммобилизация антител для захвата на твердой фазе, внесение анализируемого образца и добавление конъюгата.
Применение моноклональных антител к Д-димеру в вестерн-блоттинге
Предлагаемые моноклональные антитела высокоэффективны при идентификации целевого аналита методом вестерн-блоттинга. Все протестированные клоны распознают Д-димер в нередуцирующих условиях, а отдельные антитела сохраняют способность связывать денатурированные полипептидные цепи и в редуцирующих условиях.
Высокоочищенный нативный Д-димер человека
На протяжении более 30 лет нативный Д-димер человека производства «Хайтест» поставляется на международный рынок для разработки и серийного выпуска диагностических тест-систем. Продукт представляет собой высокоочищенный антиген, выделенный непосредственно из плазмы крови человека, и характеризуется строгим соответствием стандартам качества и воспроизводимостью от серии к серии.
Список литературы и публикации ученых:
Актуальный перечень научных работ и патентов сотрудников компании доступен в специализированном разделе Статьи Хайтест.
Полный список независимых упоминаний и исследований Д-димера представлен в международной базе данных PubMed.
Вернуться к списку
